在生物制药及生命科学研究中，蛋白质的纯度与均一性是关键质量属性（CQA），直接影响生物制品的安全性、有效性及稳定性。尺寸排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）以其高分辨率、温和分离和定量能力，已成为蛋白质纯度及聚集状态分析的核心技术。本文将介绍SEC-HPLC的原理、操作要点、关键参数及数据解读方法。

一、SEC-HPLC的原理与优势

SEC-HPLC（Size Exclusion Chromatography-High Performance Liquid Chromatography）基于分子体积大小进行分离。色谱柱内填充多孔硅胶或高分子凝胶材料，蛋白质分子在流动相中通过“筛分效应”进入或排除孔隙，分离以分子体积为依据。大分子因无法进入孔隙而快速洗脱，小分子则被延迟。

主要优势包括：

• 高分辨率与良好重现性：可区分蛋白单体、寡聚体及聚集体；
• 温和分离条件：非变性分离，保持蛋白结构与活性；
• 定量能力突出：紫外吸收等检测器可实现组分定量分析；
• 适用范围广：涵盖单克隆抗体、疫苗、重组蛋白、酶等多种生物制品。

二、样品制备与系统优化

1、样品准备

为确保柱效和数据准确性，样品需严格预处理：

• 使用0.22 µm过滤器去除颗粒杂质，避免堵塞柱床；
• 缓冲液与流动相匹配，保持蛋白稳定性，避免因缓冲液不同引起基线漂移或峰变形；
• 控制样品浓度，过高可能导致柱过载和峰展宽，过低则信号不足。

2、色谱柱与流动相

选择合适孔径（如300 Å或更高）和粒径（3–5 µm）的SEC色谱柱，确保分离蛋白质单体与聚集体。流动相多采用生理盐浓度（如150 mM NaCl）和中性缓冲液（如磷酸盐缓冲液），以减少非特异吸附并保持蛋白构象。优化流速（一般0.2–0.5 mL/min）以兼顾分辨率与分析时间。

3、系统验证

SEC-HPLC分析前应进行系统适用性验证，包括：

• 柱效（理论塔板数）；
• 保留时间重现性（RSD<1%）；
• 峰面积线性范围；
• 分子量校准曲线的准确性（不涉及具体标准物质品牌）。

三、检测与数据分析

常用检测器为紫外检测器（UV），检测波长一般为280 nm，适合蛋白质芳香族残基吸收特性。对于复杂样品，可引入多角度光散射（MALS）和示差折光（RI）检测，获取分子量分布与浓度信息。

数据解读关键指标包括：

• 纯度评估：主峰面积占总峰面积的百分比，反映蛋白纯度；
• 均一性分析：考察单体峰对称性、半峰宽（FWHM）、保留时间是否稳定；
• 聚集体检测：早洗脱峰（大体积）指示高分子聚集体含量；
• 降解产物识别：晚洗脱峰（小体积）可能指示低分子降解产物；
• 分子量确认：利用分子量校准曲线，推算各组分分子量，结合MALS检测结果验证均一性。

四、SEC-HPLC在生物制药中的应用价值

SEC-HPLC在生物药物开发的多个环节扮演关键角色：

• 药物研发：监测重组蛋白、单抗制备过程中的纯度和聚集体含量；
• 工艺开发：优化上游表达与下游纯化工艺，确保最终产品的质量；
• 质量控制：作为放行与稳定性检测的重要手段，评估批间一致性与长期稳定性；
• 法规符合性：符合ICH Q6B等国际质量规范要求，支持注册申报资料。

SEC-HPLC因其温和、高分辨率及定量能力，已成为蛋白质纯度与均一性分析的核心技术。通过合理的样品准备、系统优化及数据解读，可全面评估蛋白质量属性，识别聚集体及降解产物，确保产品安全与有效性。百泰派克生物科技依托先进的SEC-HPLC平台与经验丰富的分析团队，提供从方法开发、系统验证到样品分析的一站式解决方案。我们的服务涵盖多种生物药及复杂蛋白产品，确保结果具有高分辨率、良好重现性及可比性，满足从研发到生产质控的多层次需求。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

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6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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